Hilfe & FAQ
Wie sollen die Proben verschickt werden?
- Immer auf Trockeneis!
Wieviel RNA wird benötigt?
- Total RNA mit rRNA-Depletion: ~ 1 µg
- Total RNA für die mRNA Anreicherung mit Oligo-dT-Fängerkügelchen: ~ 100 ng (ggf. auch nur 10 ng bei hoher Qualität)
- Total RNA von ultra low input Proben: ~ 10 pg - 10 ng (siehe auch SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing)
Für welche Organismen gibt es Lösungen für die rRNA Depletion:
- Illumina TruSeq Stranded Total RNA Gold: human, Maus, Ratte
- Illumina TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Globin (Globin mRNA inkl. rRNA Depletion): human, Maus, Ratte
- siTOOLs Biotech Pan-Prokaryote riboPOOL: Bakterien / Archaea
Tipps zum Arbeiten mit RNA:
- Tragen von „frischen“ Einmalhandschuhen
- Säuberung des Arbeitsplatzes und der Arbeitsgeräte (Pipetten, …) mit Reinigungslösungen wie z.B. RNaseZAP, RNase Away, …
- Räumliche Trennung des Arbeitsplatzes für RNA-Arbeiten von Arbeitsplätzen an denen mit RNase gearbeitet wird
- Verwendung von sterilen Filter-Pipettenspitzen
- Verwendung von sterilen Einwegkunststoffen sowie von DEPC-behandelten Reagenzien und Glaswaren
- Protokolle zügig durchführen mit kurzen Inkubationszeiten auf Eis und die Reaktionsgefäße so oft als möglich geschlossen halten
- wenn möglich Verwendung von Nuklease-freiem Wasser (DEPC-behandelt oder DNase/RNase-frei)
- Lagerung von RNA bei -80°C in Nuklease-freiem Wasser (bis zu 1 Jahr)
- Link: “The Do's and Don'ts of Working with RNA”
Wieviel DNA wird benötigt?
- ca. 50 ng eukaryotische genomische DNA in 2 µl für WES
- ca. 1 ng genomische DNA (z.B. Bakterien-DNA) in 1 µl für Tagmentation (Transposase-basierte enzymatische DNA-Fragmentierung (ca. alle 300 bp) mit Adaptor-Ligation zur PCR-Amplifikation)
Tipps für die Stabilisierung von RNA:
- für Zellen: resuspendiere pelletierte Zellen (ca. 0.5-1x10^6) in 0.3 mL RNAprotect Cell Reagent (z.B. QIAGEN Cat No. 76526) und lagere die Suspension für 1 Tag bei 4°C und danach bei -80°C bis zur RNA-Isolation
- für Gewebe: stelle Gewebestückchen her von ca. 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm. Überführe das Gewebestückchen in ein 2 ml Mikrozentrifugationsgefäß gefüllt mit 2 ml RNAlater (z.B. ThermoFisher QIAGEN Cat No. AM7020). Lagere die Flüssigkeit für 1 Tag bei 4°C und dann bei -80°C bis zur RNA-Isolation
Tipps für die Stabilisierung von DNA:
- für isolierte DNA: gib 25 μl DNAstable Plus (z.B. Biomatrica Cat No. 53091-016) zu 100 μl DNA (0.001 bis zu 250 µg) und lagere die Flüssigkeit bis zu 12 Monate bei Raumtemperatur oder 4°C
- für Blut-Proben: mische 200 µL Blut mit der DNAstable Blood matrix (z.B. Biomatrica Cat No. 93027-027) in einem Mikrozentrifugationsgefäß, trockne die Matrix und lagere die getrocknete Matrix bis zu 12 Monate bei Raumtemperatur oder -20°C
- Für Zellen und Gewebe: überführe ca. 10 mg Gewebe in 100 µL DNAgard Tissue oder resuspendiere pelletierte Zellen (ca. 0.5-1x10^6) in 100 µL DNAgard Tissue (z.B. Biomatrica Cat No. 62001-046). Lagere Zellen oder Gewebe bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur oder -20°C.
